돼지 분변에서 분리한 유산균의 Probiotics 활성 비교

유산균 분리를 위한 선택배지는 전보에서 사용한 3종의 배지를 사용하였다[16]. BHI-CM(Brain heart infusion-cysteine-mucin; pH 7.4) 배지는 분변 중에 존재하는 전체 미생물 군집을 조사하기 위해 사용하였으며, MRS-C(de Man Rogosa Sharpe-cysteine; pH 5.0) 배지는 분변 중의 유산균을 조사하고자 사용하였다. BL-NPNL(Blood liver-nalidixic acid-paromomycin-neomycin-litium chloride; pH 7.2) 배지는 발효유제품의 Bifidobacterium 속을 검출하는 선택배지로 잘 알려져 있는데[17], 본 연구에서는 분변 중의 Bifidobacterium 속을 분리하고자 사용하였다.

분변 시료는 전라남도 진도군 소재 농장에서 사육 중인 모돈(4산차)과 이유자돈(9주령, 암컷)으로부터 채취하였다. 돼지 분변은 혐기성 희석액으로 십진 희석한 뒤 각각의 배지에 도말하여 37℃에서 72시간 동안 혐기 배양(Bugbox; Ruskinn Technology, UK)한 뒤 유백색 집락을 분리하였다. 균주의 동정을 위한 primer는 forward primer(27F, 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') 및 reverse primer(1492R, 5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였고, 16S rDNA 유전자 염기서열 분석(Solgent, Korea)을 하여 NCBI GenBank 데이터베이스에 수록된 서열과 비교해 최종 동정하였다.

내담즙산성은 0.05%(w/v) L-cysteine이 포함된 MRS 배지에 여과 멸균한 oxgall(Difco, USA) 용액을 0.3%(w/v) 농도로 첨가하여 준비한 후, 유산균 현탁액을 접종하여 평가하였다. 시료는 37℃에서 24시간 배양하였으며, 배양 후 생균수를 측정하여 평가하였다.

내산성 평가는 MRS 배지에 0.05%(w/v) L-cysteine과 pepsin(1,000 unit/mL, Sigma-Aldrich, USA)을 첨가한 다음 pH를 2.5로 조정하여 선발 미생물을 약 1~5×10⁵ CFU/mL 수준으로 접종한 후, 37℃에서 2시간 동안 배양하여 생균수를 측정하였다.

HT-29 세포는 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Gibco, USA) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 세포 단층이 형성될 때까지 배양하였다. 이후 각 well에 항생제가 첨가되지 않은 DMEM으로 약 1.0×10⁸ CFU/mL 농도까지 균주를 현탁하여 접종한 뒤, 37℃, 5% CO₂조건에서 2시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후에는 부착되지 않은 균을 제거하기 위해 PBS buffer로 3회 세척하였다. 0.1% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 떼어낸 후 0.05%(w/v) L-cysteine이 첨가된 MRS 배지에서 37℃, 48 h 동안 혐기 배양하여 생균수를 평가하였다.

본 연구의 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였으며, 실험 결과는 SAS software를 이용하여 분석하였다. 총균수의 차이는 Student’s t-test를 통해 비교하였으며, 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 판정하였다[18].

3종의 선택배지에서 평가한 분변 내 혐기성 세균의 총 생균수는 Fig. 1에 제시된 바와 같다. 이유자돈의 분변에서 혐기성 미생물은 BHI-CM, MRS-C, 및 BL-NPNL 배지에서 각각 6.71, 6.14, 및 6.22 log CFU/g feces로 나타났다(Fig. 1). 반면, 모돈의 분변에서는 동일한 배지에서 각각 8.54, 7.41, 및 6.15 log CFU/g feces으로 나타나, 전반적으로 모돈의 분변이 이유자돈의 분변보다 다소 높은 생균수를 보였다.

Fig. 1. Total viable cell counts of anaerobic bacteria isolated from the feces of a weaning piglet and a sow. The anaerobic bacteria were anaerobically enumerated using brain heart infusion containing cysteine and mucin agar (BHI-CM), de Man Rogosa Sharpe-cysteine agar (MRS-C; pH 5.0), and blood liver-nalidixic acid-paromomycin-neomycin-lithium chloride agar (BL-NPNL; pH 7.2). Values represent viable cell counts (log CFU/g feces) of anaerobic bacteria isolated from sow feces ( ) and piglet feces ( ).

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Table 1은 각 배지에서 집락의 형태 및 크기 등을 관찰한 후, 선별된 특징적인 집락의 수를 나타낸 것이다. 자돈과 모돈분변에서 각각 133개와 146개의 유백색의 집락을 선별하였으며, BHI-CM 배지에서 139개, MRS-C 배지에서 70개, BL-NPNL 배지에서 70개의 집락을 분리하였다. 선별된 집락을 각 배지에서 계대 배양한 후 16S rDNA 서열분석으로 동정한 결과 20종을 확인할 수 있었으며, 72개의 균주는 미동정 상태로 남았다. 미동정 집락은 BHI-CM 배지에서 가장 많이 분리되었으며, 모돈 분변의 미동정 균주 비율은 BHI-CM, MRS-C, 및 BL-NPNL에서 각각 18.4%, 14.9%, 및 8.6%로 나타났고, 자돈 분변에서는 각각 42.9%, 37.1% 및 28.6%로 더 높은 비율을 보였다. 미동정된 집락들은 현재 추가적인 분석을 통해 species를 규명하고 있다.

Table 2는 모돈과 이유자돈의 분변에서 분리한 미생물을 동정한 결과이다. BHI-CM 배지는 편성 혐기성 세균들과 유산균과 같은 통성 혐기성 세균들을 포함하여 총 17종의 세균이 검출되었다. BHI-CM 배지에서는 0.2%의 포도당과 0.5%의 mucin을 첨가하였기 때문에 mucin을 분해하거나 이를 이용할 수 있는 균주들이 성장할 수 있는 환경을 제공하였다. 이러한 조건 하에서 Selenomonas bovis와 Bifidobacterium boum 같은 균주들을 선발할 수 있었다.

Fig. 2. Microscopic morphology of lactic acid bacteria isolated from the feces of a weaning piglet and a sow. (A) Ligilactobacillus ruminis SY1, (B) Limosilactobacillus reuteri SY2, (C) Limosilactobacillus mucosae SY3, (D) Lactobacillus amylovorus SY4, (E) Ligilactobacillus agilis SY5, (F) Pediococcus pentosaceus SY6, (G) Streptococcus hyointestinalis SY7, and (H) Bifidobacterium boum SY611.

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Tailford et al.(2015)은 포도당 대신 mucin을 첨가한 배지에서 Akkermansia muciniphila와 같은 장내 세균을 검출할 수 있어, mucin이 다양한 장내 미생물의 배양에 적절한 환경을 제공한다고 보고하였다[19]. 이는 장내 세균들이 mucin을 분해하는 sialidase, fucosidase, 및 sulfatase과 같은 효소를 보유하고 있어 mucin을 에너지원으로 활용할 수 있기 때문이다. 특히 mucin을 분해할 수 있는 특정 미생물이 분해산물을 생성하면, 다른 공생 미생물들이 이를 2차 대사산물로 이용하는 상호작용이 이루어질 수 있다. 따라서 mucin의 첨가는 다양한 장내 미생물을 효과적으로 검출하는데 유리한 것으로 판단되었다.

Table 2의 결과에 따르면, MRS-C 배지에서는 5종의 유산균이 검출되었고, BL-NPNL 배지에서는 L. ruminis 1종의 유산균만이 확인되었으며, bifidobacteria는 검출되지 않았다. 본 실험에서 분리한 유산균 7종 중 3종은 모돈과 자돈의 분변에서 공통적으로 동정된 species였다. 그러나 자돈 분변에서는 포자를 형성하는 호기성 세균인 Paenibacillus phoenicis의 집락도 검출되었는데, 이는 분변 채취 과정 중 외부 오염일 가능성 또는 분변 내 존재하던 포자 형태의 세균이 배양 중 발아했을 것이다.

자돈은 출생 직전까지 무균 상태를 유지하지만, 출생 시 자궁 경부를 통과하는 과정에서 모체의 질 및 회음부에 존재하는 미생물과 접촉하게 된다[20]. 또한 포유기 동안 자돈은 모돈의 젖꼭지, 피부 및 분변을 통해 다양한 미생물에 노출되며, 이를 통해 모돈의 장내 미생물이 자돈에 전달된다[21].

본 연구에서 분리한 세균 중에서 그람양성, Catalase 음성, 및 γ-용혈성을 나타내는 8종을 최종 선발하여 프로바이오틱스 활성 평가를 진행하였으며, 이들 균주의 현미경 관찰 결과는 Fig. 3에 나타내었다.

Fig. 3. Bile tolerance of lactic acid bacteria isolated from the feces of a weaning piglet and a sow. (A) Viable cell counts (log CFU/mL) and (B) survival rates (%) of the isolates after 24 h of incubation in MRS medium containing 0.3% oxgall. Values at 0 h ( ) and 24 h ( ) represent the initial and final cell concentrations, respectively.

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Fig. 3은 선발 유산균에 대한 내담즙산성을 평가한 것으로, 총 6종의 유산균이 0.3% oxgall을 포함한 배지에서도 생육이 가능한 것으로 확인되었다. Gilliland et al.(1984)은 유산균이 프로바이오틱스로서의 기능을 수행하기 위해서는 최소한 0.3% oxgall 함유 배지에서 생육할 수 있는 담즙산 내성을 갖추어야 한다고 제안하였다[22]. 본 실험에서 SY611, SY1, 및 SY6 균주는 155.02%, 142.77% 및 142.28%의 상대 생존성을 보여, 담즙산이 존재하는 장내 환경에서도 높은 생존 가능성이 있음을 시사한다.

Fig. 4는 8종의 선발 유산균의 내산성 평가 결과를 나타낸 것이다. SY1, SY2, 및 SY611 균주는 각각 95.13%, 94.95% 및 92.15%의 생존율을 보여, 내산성이 우수한 상위 3개 균주로 확인되었다. 그러나 SY6, SY7 및 SY4 균주는 각각 58.16%, 51.89% 및 53.68%의 생존율을 보여 상대적으로 낮은 내산성을 보였다.

Fig. 4. Acid tolerance of lactic acid bacteria isolated from the feces of a weaning piglet and a sow. (A) Viable cell counts (log CFU/mL) and (B) survival rates (%) after 24 h of incubation in modified MRS broth adjusted to pH 2. Values at 0 h ( ) and 2 h ( ) represent the initial and final cell concentrations, respectively.

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Park et al.(2024)은 Ligilactobacillus ruminis CACC881 균주에 대한 전장 유전체 분석을 통해, 해당 균주가 산성 스트레스 조건에서 F₀F₁-ATPase 시스템을 활성화시켜 세포 내 pH 항상성을 조절하는 메커니즘을 보유하는 것으로 보고하였다[23]. 이러한 결과는 유산균의 내산성에 관여하는 분자 수준의 생존 전략을 이해하는 데 중요한 근거를 제공한다.

Fig. 5는 HT-29 세포주를 이용하여 선발 유산균의 장세포 부착능을 평가한 결과를 나타낸 것이다. SY2 균주는 86.34%의 부착율을 보였으며, SY6와 SY611은 각각 79.19%와 69.58%의 부착율을 나타내었다. 일반적으로 L. reuteri 균주들은 비교적 장내 부착성이 우수한 것으로 알려져 있으며, 특히 L. reuteri에서 세포 표면 단백질인 srtA 유전자를 돌연변이시킨 경우, 장세포에 대한 부착력이 현저하게 감소하는 것으로 보고되었다. 이는 srtA가 장세포 부착성에 중요한 역할을 수행함을 시사한다[24].

Fig. 5. Adhesion assay of lactic acid bacteria isolated from the feces of a weaning piglet and a sow. (A) Viable cell counts (log CFU/mL) and (B) adhesion rates (%) after 24 h of incubation with HT-29 cells. Bars indicate the number of inoculated cells ( ) and the number of adherent cells remaining after 3 washes ( ).

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SY611 균주는 본 연구에서 평가한 유산균 중 내산성(92.15%)과 내담즙성(155.02%)이 모두 가장 우수하게 나타난 균주로, 위장관을 살아서 통과하여 장내에서 안정적으로 생존하고 정착할 가능성이 높은 것으로 판단된다.

또한 Pediococcus 속을 포함한 일부 유산균은 세포 외 다당류(exopolysaccharide)를 분비하여 장 점막과의 상호작용을 강화함으로써 장 상피세포에 대한 부착력을 증가시키는 것으로 보고되어 있다[25].

본 연구에서는 건강한 모돈과 이유자돈의 분변에서 미생물을 분리하고, 이들에 대한 기초적인 프로바이오틱스 활성을 평가하였다. 각 균주의 내담즙성, 내산성 및 장세포 부착능을 종합적으로 비교한 결과는 Table 3에 요약하였다. Table 3에서는 내담즙성 활성 평가를 위해 초기 균수 대비 감소 정도에 따라 2 log 이상 감소(−−), 1–2 log 감소(−), 초기 균수와 유사(+), 1–2 log 증가(++), 3 log 이상 증가(+++)로 구분하였다. 내산성은 1.5 log 이상 감소(−−), 0.5–1.5 log 감소(+), 0.5–1.0 log 감소(+), 0.5 log 이하 감소(++), 초기 균수 유지(+++)로 각각 표시하였다. 부착능은 초기 접종 균수 보다 3 log 이상 감소(−), 2–3 log 감소(+), 2 log 이하 감소(++)로 각각 구분하였다.

이러한 기준에 따라 분석한 결과, SY1, SY2 및 SY611 균주는 내산성과 내담즙성에서 모두 우수한 내성을 나타냈으며, 장 상피세포에 대한 부착능도 상대적으로 높게 나타났다. 따라서 이들 균주는 위장관을 효과적으로 통과하고 장내에 안정적으로 정착할 가능성이 높은 유망한 프로바이오틱스 후보로 판단된다.