비피도박테리아의 생존성 증진을 위한 캡슐화 기술

사출과 유화 기술은 프로바이오틱 미생물 캡슐화의 2가지 기초적 방법이다. 일반적으로, 사출 기술은 간단하고 저렴한 방법으로 세포손상을 최소화하여 프로바이오틱 세포가 상대적으로 높은 생존성을 갖도록 한다. 생체적합성과 유연성도 이 방법의 장점이다. 이 방법의 가장 중요한 단점은 비드의 생성이 늦어 대규모 생산에 적용할 수 없다는 것이다. 일반적으로 이 방법으로 생성되는 비드의 크기(2~5 mm)는 유화법에 의해 생산되는 비드보다 크다(예, 유화법으로 만들어진 구형 비드는 지름이 25 μm에서 2 mm). 사출법에서 캡슐의 크기는 sodium alginate 용액의 점도, 사출기 구멍 지름, 그리고 주사기와 calcium chloride 수집 용액과의 거리에 달려 있다(Smidsrod and Skjak-Braek, 1990). 높은 sodium alginate 농도는 점도가 높아 입자를 크게 만든다. 저온 사출법은 미생물과 효소의 캡슐화에 사용될 수 있다.

유화법은 유화 형성을 위해 식물 기름을 사용하기 때문에 사출법보다 비싸다(Mortazavian et al., 2007). 이 방법에서 작은 부피의 세포/중합 슬러리(분산상)는 해바라기, 대두, 옥수수, 또는 파라핀오일 과 같은 큰 부피의 식물 기름(연속상)에 첨가한다. Sheu and Marshall (1993)은 w/o 시스템을 이용하여 박테리아를 가두는 법을 개발했다. 캡슐화 물질을 우선 박테리아와 혼합하고 혼합물을 Tween 80(유화제)을 포함하는 기름조에 분산한다. 그 다음, 생산된 유화물은 CaCl₂를 첨가하여 유화를 파괴하고 생산된 캡슐은 원심분리로 수집한다. 젤화 전 캡슐 믹스의 농도와 점도, 혼합물의 교반속도 그리고 유화제 종류는 최종 형성되는 비드의 지름을 결정하는 중요한 지표로 보고되었다. 매우 큰 비드(약 1,000 μm 이상)는 거친 조직과 약한 구조일 수 있다(Mortazavian et al., 2008). 비드의 지름은 프로바이오틱 세포의 생존성과 대사 속도 및 최종 제품의 관능적 특성에 유의적으로 영향을 미치며 또한 제품내 비드의 분산 품질에도 영향을 미친다(Mortazavian et al., 2007; Mortazavian and Sohrabvandi, 2006).

동결건조와 분무건조법의 사용과 이 두 공정의 핵심 지표는 높은 생존수준에 중요하다(Anal and Singh, 2007). 동결건조와 분부건조법은 대규모 프로바이오틱스의 캡슐화에 사용될 수 있으나, 두 방법 모두 미생물이 극한 환경조건에 노출된다. Semyonov et al.(2010)은 높은 생존성의 L. paracasei 건조 캡슐 제조를 위해 분무-동결건조(SFD)를 평가하였다. 그들은 maltodextrin과 trehalose로 캡슐화된 세포의 생존성을 조사하였다. 결과적으로, SFD는 높은 생존성(>60%)의 건조 캡슐 생산에 사용될 수 있다. Trehalose 농도와 maltodextrin 분자량이 최종 프로바이오틱 생존성에 영향을 미치는 주요한 요인으로 보인다. 분무건조는 분무기 형태, 공기압과 출구 공기 온도와 같은 주요 지표가 조절되면 경제적으로 다량의 프로바이오틱 미생물 생산에 사용될 수 있다(Gardiner et al., 2000; Champagne and Mollgaard, 2008).

동결건조에서 제품은 임계온도 이하로 동결된 후에 압력이 낮아지는 일차 건조과정이 따르며, 선반 온도는 보통 증가하고 비결합수는 승화에 의해 제거된다. 최종적으로, 이차 건조단계는 탈착에 의해 결합수가 제거되고, 제품은 점차 상온으로 돌아온다(Jennings, 1999; Oetjen, 1999). 동결건조 기술에서 배지의 pH, 보호제 함량(예, 탄수화물), 생물량 이력(배지 환경, 수확 시기), 초기 세포 농도, 동결 속도 및 온도(예, 액체질소의 사용)를 포함하는 중요 인자들이 조절되어야 한다(Carvalho et al., 2004). 동결 건조동안 생존성 손실에 극히 중요한 요인은 세포내 빙결 형성과 재결정으로 발생되는 삼투압 충격과 세포막 손상이다.

캡슐 제조에 제안된 많은 방법 중에서 분무건조는 작고 조절 가능한 입자 크기로 물에 불용성인 건조 캡슐 제조에 가장 적절한 기술이다(Picot and Lacroix, 2003.; Groboillot et al., 1994). 이 시스템은 높은 안정성, 취급 용이성과 미생물 저장 및 식품의 관능적 특성에 미치는 제한된 효과 등 다양한 이유로 고정화된 프로바이오틱 미생물을 식품에 첨가하는데 이상적이다. 그런데, 분무건조에 의한 프로바이오틱 미생물의 캡슐화는 열에 의한 불활화 때문에 거의 고려되지 않는다. 분무건조 과정 동안 높은 공기 온도에 노출되는 것은 미생물의 생존성에 부정적 영향을 미친다. 반대로, 생물 물질의 안정성에 물의 역할이 중요하기 때문에, 물의 제거는 박테리아 세포막과 단백질의 기능 및 구조에 비가역적 변화를 일으킬 수 있다(Picot and Lacroix, 2003).

프로바이오틱스를 스트레스와 열처리에서 보호하기 위해 연구자들은 다양한 캐리어 매질 시스템을 사용하여 저항성을 연구하였다(Leverrier et al., 2005; Boza et al., 2004). Lian et al.(2002)은 프로바이오틱 스트레인과 캐리어가 분무건조 후에 비피도박테리아의 생존성에 미치는 영향을 연구하였다. 그 결과, 10%(w/w) gelatine, 아라비아 검 또는 가용성 전분에서 분무건조시 비피도박테리아의 가장 높은 생존성을 보였다. 미생물 중에서 B. longum B6가 실험조건하에서 분무건조에 가장 둔감하였다. 또한, B. longum B6와 B. infantis CCRC 146336을 젤라틴, 가용성전분, 탈지유 또는 아라비아 검의 10%(w/w) 캐리어 물질과 분무건조하여 캡슐화하였고, 이들 미생물의 생존성을 모사된 위액(pH 2.0과 3.0) 및 담즙액(0.5%와 2.0%)에서 시험하였으며, 분무건조에 의한 프로바이오틱 미생물의 캡슐화는 위액에 노출 시 높은 생존성을 보인다고 결론지었다. 스트레스 처리, 탈수 전 미생물의 생장기, 유전적 변형 및 생장배지처럼 여러 가지 요인들이 탈수동안 프로바이오틱 미생물의 생존성에 영향을 줄 수 있다. 급격한 환경 변화에 박테리아가 세포상태의 저항성 증가를 유도하는 대사적 재프로그램으로 반응한다는 것이 밝혀졌다. 미생물의 스트레스 반응이 생장기에 달려 있다는 것도 잘 알려져 있다. Saarela et al.(2004)은 B. animalis subsp. lactis의 늦은 대수기(15 h) 또는 이른 정체기에 동결건조 및 저장 안정성을 보고하였다. 유산균의 열 및 삼투압 저항성은 종 의존적이다. 분무건조 후 프로바이오틱스의 생존성은 사용된 캐리어의 종류 및 농도뿐만 아니라, 분무건조기의 배기 온도에 달려 있다(Ananta et al., 2005; Hisiao et al.; Lian et al., 2003; Lian et al., 2002). B. animalis subsp. lactis는 배기온도 80~90℃에 환원탈지유(20% w/v)에서 분무 건조 시 70% 이상 생존했음을 보였다(Simpson et al., 2005). 탈수 동안 프로바이오틱스의 생존성을 보호하기 위해 분무건조와 냉동건조 전에 다양한 보호제를 첨가한다(Morgan et al., 2006). 탈지유 분말, 유청 단백질, 트레할로스, 글리세롤, 베타인, 설탕, 포도당, 유당, adonitol과 폴리머(예, polyethylene glycol 및 dextran)이 보호제로 사용된다(Anal and Singh, 2007; Heidebach et al., 2010; Lian et al., 2002). 탄수화물의 첨가가 프로바이오틱스의 생존성을 개선 하고 동결건조 중 박테리아에 보호 효과가 있다는 것은 잘 기술되어 있다. 트레할로스가 동결건조 시 효과적인 동결보호제라는 것도 보고되었으며(Conrad et al., 2000; Patist and Zoerb, 2005), 트레할로스, 트레할로스/유당 및 유당/말토스는 동결건조에 가장 효과적인 이당류로 보고되었다(Meng et al., 2008). 요구르트 및 동결건조 요구르트에서 프로바이오틱 박테리아(L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus 및 Bifidobacterium spp.)의 생존성에 미치는 캡슐화, 프리바이오틱스, 그리고 동결보호제의 영향이 연구된 바 있다(Capela et al., 2006). 동결보호제(Unipectine ^TM RS 150) 2.5%(w/v) 첨가 시 L. casei 생존성이 7% 개선되었고, 프리바이오틱 (Raftilose ^TM RS 150) 1.5%(w/v) 첨가 시 4℃에서 4주간 저장 시 프로바이오틱 미생물 생존성을 log 1.42 증진시켰다. Alginate로 캡슐화 시 동결건조 요구르트를 21℃에 저장시 프로바이오틱 미생물의 생존성을 log 0.31 증진시켰다. 동결보호제로 일반적으로 사용되는 탈지유와 설탕은 세포내 손상을 방지할 수 있다고 생각된다. 설탕의 보호작용은 고점도 또는 유리상(glass- like phase)에서 염을 포착함으로써 손상을 일으키는 세포액의 공융을 제한하는 능력때문이라고 제안되고 있는 반면, 탈지유는 세포막을 안정화함으로써 세포 손상을 방지할 수 있다(Saarela et al., 2006). 목적을 고려한 캡슐 재질의 선택은 매우 중요하다. 예를 들어, alginate 캡슐에서 칼슘 이온이 누출되면 분해될 수 있으므로, alginate 캡슐은 높은 산도와 킬레이팅 물질이 함유된 환경을 피해야 한다. 그런데, 액상 우유, 크림 및 요구르트와 같은 우유 기반 매질은 고수준의 칼슘 때문에 젤 구조에서 칼슘 이온의 용출이 제한될 수 있어 젤 구슬이 모양과 주조를 유지한다(Hansen et al., 2002). 캡슐 물질로 저항 전분을 이용하면 구슬이 효소 분해에 저항성을 만든다. 때로는 고수분 제품 조건에 저항성 구슬을 만드는 것이 소수성 성분의 캡슐화에 필요하다(Hansenet al., 2002).

캡슐 제조 용액의 농도와 최종 구슬 지름은 캡슐화 효율에 중요한 요인이다. 구슬 지름 증가에 따라 극심한 환경 요인에 대한 보호 효과가 증가한다(Hansen et al., 2002). Sultana et al.(2000)은 지름이 0.5~1.0 mm인 alginate 캡슐은 요구르트의 냉장저장 중 비피도박테리아의 생존성을 유의하게 증가하나, 모사 위액 pH에서는 그렇지 못하다고 보고했다. 특별한 한계(캡슐과 제품의 형태를 고려) 이상으로 구슬의 지름을 증가시키는 것은 부적절한 입맛 및 풍미 때문에 적절하지 못하다. 게다가, 캡슐 지름 증가는 소화 효소에 의한 분해를 감소시키므로, 캡슐 형성에 저항성 전분을 사용할 때 지름을 증가시키는 것은 주의해야 한다(Dimantov et al., 2003). 캡슐 제조 농도 관련 연구에서 alginate 용액 농도를 0.75%에서 1.8%로 높이는 것은 L. acidophilus의 위액 모사조건하 생존성을 높인다는 것을 보였으나, 2% 이상은 용액 점도 증가로 구형 및 균일한 구슬 제조가 불가능하였다(Chandramouli et al., 2004). 해로운 환경요인의 형태와 정도는 캡슐 효율성을 낮추는 가장 중요한 지표중 하나이다. 예를 들어, 캡슐은 위액과 같은 심한 산성 조건보다 요구르트 같은 약한 산성 조건을 견딘다(Sultana et al., 2000; Hansen et al., 2002). 지름 100 μm의 alginate 캡슐은 대부분의 발효제품에 효과적이나, 위산은 그렇지 못하다(Cui et al., 2000). 캡슐화된 박테리아에 의한 전분의 분해도 보고된바 있으므로(Takata et al., 1977), 캡슐 재질의 선택 전에 박테리아가 전분을 분해할 수 있는지도 고려되어야 한다.

프로바이오틱스의 캡슐화는 발효유제품의 관능적 품질에 특정한 결과를 가져온다. 최종 제품의 관능적 특성에 영향을 미치는 캡슐의 모양과 크기는 산업적 생산에 중요한 문제이다. 게다가, 분무건조시에 배기 온도는 메일라드 반응(카라멜화와 유사한 비효소적 갈변화의 형태) 때문에 캡슐의 색깔에 영향을 미칠 수 있다(McMaster et al., 2005; O’Riordan et al., 2001; Su et al., 2007). 캡슐화된 프로바이오틱 미생물의 첨가는 외관 및 색깔, 산도, 풍미, 또는 요구르트의 후미를 변화시키지 않으나, 조직적 특성에 영향을 미친다(Krasaekoopt et al., 2006). 비록 프로바이오틱스의 캡슐화가 관능적 특성을 개선하는 효과적 방법으로 적용될 수 있어도 부적절한 사용은 최종 제품의 이취 및 조직감 손상을 가져올 수 있다. 예를 들어, 우유 내 B. longum 및 B. lactis의 캡슐화는 특별한 이취를 발생한다. 이러한 사실은 세포의 캡슐화로 작은 쓴맛 펩타이드를 생산하는 대사경로의 변화 때문이다(Truelstrup Hansen et al., 2002). Adhikari et al.(2002)은 비피도박테리아를 발효 전에 첨가시 캡슐화가 요구르트내 아세트산 농도를 낮췄다. Bifidobacterium 속이 생산하는 아세트산은 요구르트 같은 발효유제품에서 식초 맛을 낸다(Adhikari et al., 2000). 이러한 이취는 저장 기간내 발효 중 생산된다. 비피도박테리아의 캡슐화는 요구르트내 아세트산 생성량을 줄여 프로바이오틱 발효유제품의 풍미를 개선하기 때문에 이러한 문제를 극복하기 위해 사용된다(Adhikari et al., 2000). 특정 한계 이상의 지름을 가진 구슬(>100 μm, 특히 1 mm 이상)은 거친 외관 때문에 액상 우유 및 요구르트의 입맛을 저해할 수 있다. 지름 1~3 mm 구슬은 최종제품의 조직과 풍미 모두에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다(Chandramouli et al., 2004). 특별한 크기 이상(캡슐과 미생물의 종류를 고려할 때)의 구슬 지름은 세포의 생존성에 영향이 없다는 것이 증명되었다.