Persister 세포와 Viable but Non-Culturable Cells 세포
Persister 세포와 VBNC(viable but non-culturable cells), 두 세포의 유형은 대사가 정지되어 있는 상태이나 다시 생존이 가능하다[1]. 이 두 세포 유형의 공통적 특징으로는, persisters[2]와 VBNC[3]가 모두 만성적인 감염에 관여하고, 둘 다 생물막[3,4]에 존재하며, 각각의 스트레스(예, 영양분, 산화성, 산성의 스트레스[1,3,5])에 의해서 생성되며 유제품 공정에 흔히 사용되는 저온살균(pasteurization)에 의해서도 생성된다는 것이 있다. 단일세포 분석을 통해 밝혀진 persister 세포 형성과정에서의 유전적 요소는 Escherichia coli의 RaiA(ribosome-associated inhibitor A), RMF(ribosome modulation fator) 그리고 Hpf(ribosome hibernation promoting factor)와 같은 단백질의 유도로 인한 리보솜 불활성화이다(Fig. 1)[6]. 불활성화된 리보솜은 다양한 스트레스 상황 속에서 alarmone인 (p)ppGpp를 통해 유발되고, (p)ppGpp ribosome dimerization model의 개시를 유도한다(Fig. 1)[7]. 단일세포 분석에서 persister 세포는 휴면기에서 나와 정상적으로 생장하기 위해, 영양소를 발견하고, (p)ppGpp와 cAMP의 농도를 감소시키며[8], 리보솜(ribosome)을 활성화시키는 요소인 HflX(high frequency of lysogeny X)[9]를 통해 리보솜이 다시 활성화된다(Fig. 1)[8]. 이렇게 재생장하는 세포는 주화성(chemotaxis)을 이용하여 영양분 탐색을 시작한다[9]. 반면, VBNC 세포의 경우 형성 메커니즘이 명확하게 밝혀지지 않았지만, 쿼럼 센싱(quorm sensing), 카탈라아제(catalase)와 같은 효소, 항생제, 온도 변화 또는 특정한 탄소원이 VBNC 세포를 재생장하게 한다는 연구가 보고되었다[10]. 하지만 몇 연구에서는 이 연구 결과와 반대되는 연구 결과로 영양분 결핍 스트레스 반응의 주매개자인 (p)ppGpp가 persister 세포에서 증가했을 때, VBNC 세포의 생성이 증가하였으며[11], VBNC는 persister 세포와 다르게 영양분을 공급해도 재생장하지 않기 때문에 VBNC를 휴면기’의 모델로 제시하는 것은 적절하지 않다라는 것이 제기되었다[12]. Wood et al.(2021)의 연구는 VBNC라고 불리는 것들 중 살아있는 부분이 persister 세포이며[1], 배양되지 않는 세포 조각은 죽은 것임을 증명하였다[1]. 20년전, Bogosian et al. (2000)의 연구에서도 마찬가지로 H2O2 스트레스를 제거함으로써 VBNC 세포로 분류된 배양할 수 없는 비브리오균(Vibrio)은 죽은 세포임을 밝혔다[13]. 또한, 콜로니(colony)를 형성할 수 없는 박테리아는 죽었다는 것을 주장하였다[14].
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투과전자 현미경을 통한 Viable but Non-Culturable Cells의 필수적 세포물질 결여와 낮은 재활성률
현미경을 이용한 박테리아 세포의 관찰은 VBNC 세포들 중에서 살아있는 persister 세포를 식별하기 위해 중요하다. 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM; Fig. 2)을 통해 E. coli persister 세포는 세포질이 구성성분으로 채워져 있다는 점에서 세포 생장의 지수기에 존재하는 세포와 유사하다는 것을 알 수 있다[1]. 대개 활발히 생장하는 세포일 때는 막대 모양을 가지고 있으나 persister 세포는 회전타원체(spheroid)로 형태를 바꾼다[1]. 이러한 persister 세포는 세포질 구성물인 리보솜을 기반[8]으로 0–6시간 안에 빠르게 휴면기를 벗어나 다시 생장하기 시작한다[1]. 반면, 5주동안의 영양소 결핍으로 형성된 96%의 E. coli VBNC 세포들은 손상되지 않은 세포막을 가지고 있지만, 정상적인 세포질 구성물이 결여되어 있다는 것을 TEM 분석을 통해 관찰할 수 있다(Fig. 2)[1]. 결론적으로 이 ‘세포질 내용물을 가지지 않은 세포 껍질’는 DNA를 포함한 정상적인 세포 요소의 결여로 다시 생장할 수 없다[1]. 게다가, 이 ‘세포 껍질’은 대사 활동이 일어나지 않는다[1]. 두 시간 동안 50°C의 열을 가한 E. coli O157:H7(enterohemorrhagic E. coli, EHEC: 장출혈성 대장균)도 50%가 빈 세포질을 가진 세포 껍질을 형성한다[15]. 그러나 이 중 다시 생장하는 세포는 밀도 높은 세포질을 가진다[15]. 또한, 식물 병원체인 Ralstonia solanacearum은 구리 스트레스로 인해 세포 껍질만을 가진 VBNC 세포가 일부 형성된다[16]. 그러므로 이 VBNC 세포는 다양한 스트레스로 인해 세포질 구성물질이 결여되어 있고, 대사활동이 일어나지 않는, 재생장하지 못하는 ‘세포 껍질’이며 실제로 이러한 특징들은 ‘VBNC 세포가 죽었다.’라는 것을 의미한다.
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세포막 염색으로 구분하는 ‘생존성’의 오류
현재까지 보고된 VBNC에 대한 연구 중 세포막 염색에 대한 해석을 기반으로 VBNC를 구별하는 것은 적절치 않은 것으로 판단된다. 예를 들어 VBNC 세포 관련 연구 중 EHEC(장출혈성 대장균)에 2시간 동안 50°C의 열을 가한 후 VBNC 세포의 수를 알아내는데 PMA(propidium monoazide)-qPCR(quantitative polymerase chain reaction)을 분석 방법으로 사용하였고, 이때 PMA로 염색되지 않은 입자가 VBNC이며 이 세포는 살아있다고 결론 내렸다[15]. 그러나 PMA-qPCR의 결과를 기반으로 VBNC 세포로 판단한 6.5×106 particles mL–1의 세포는 재배양하였음에도 불구하고 다시 생장할 수 없었다[15]. 이 VBNC가 다시 살아날 수 있는 조건은 2시간 미만의 열처리 혹은 더 낮은 열을 가했을 때와 배양 가능한 세포가 존재할 때뿐이다[15]. 즉, 콜로니를 다시 형성할 수 있는 세포는 세포 껍질만을 가진 VBNC 세포가 아닌, 세포질의 밀도가 높은 VBNC 세포만이 생장이 가능한 부분인 것이다[15]. 게다가, 이 연구의 TEM 이미지는 2시간의 열 처리 후, 많은 세포들이 회전타원체가 되고 단백질 응집과 빈 세포질 상태를 보이는데, 이는 확실히 세포가 재생장할 수 없다는 것을 보여준다[15]. 반면에 콜로니를 형성할 수 있는 세포는 손상되지 않은 세포막을 가지고 있고, 이 세포들은 PMA에 의해 염색이 되지 않았으므로 살아있는 것으로 간주되었다[15]. Wood et al.(2021) 연구 그룹은 영양소 결핍으로 형성된 EHEC(장출혈성 대장균) VBNC의 살아있는 부분이 persister 세포라는 것을 규명하였다[1]. 결정적으로, TEM 이미지를 통해서 재생장할 수 없는 세포들은 세포질이 부족하기 때문에 죽은 세포라는 것과, 세포막을 침투할 수 없는 PI(propidium iodide)와 같은 DNA 염색 염료는 세포질의 필수 구성성분의 결여에도 불구하고 손상되지 않은 세포막[1]을 가지고 있으면 DNA가 염색되지 않아 죽었음을 나타낼 수 없기 때문에 VBNC를 연구하는데 적절한 도구가 아니라는 것을 증명하였다.
Viable but Non-Culturable Cells에서 발견되는 응집된 단백질
VBNC의 특징 중 하나로 주장되는 것은 1,000개 이상의 응집된 단백질이 발견되었고 그 응집된 단백질 중에 세포 껍질을 재생장할 수 있게 하는 단백질이 존재한다는 것이다[15,17]. 그러나 변성된 단백질이 세포의 생명을 복원하는 생물학적 과정은 알려지지 않았기 때문에 많은 수의 변성 단백질의 재구성은 불가능한 일이다. 특히 많은 수의 변성된 단백질의 응집은 세포의 죽음을 의미한다[14]. 몇몇 VBNC 세포 관련 연구자들[15,17]과 심지어 persister 세포 관련 연구자들[18,19]에 의한 ‘복원할 수 있는 응집체’와 ‘단백질 응집성’에 대한 주장은 단백질 응집체 데이터[15,17,19]에서 알 수 있듯이 VBNC 세포는 죽은 것임을 확실히 증명한다.
고 찰
국립수의과학검역원(NVRQS)에서 2004년부터 2008년 사이에 435곳의 축사에서 얻은 12,508개의 우유 샘플에서 Enterococci[20]와 Streptococci[21]를 분리해 항생제 내성 실험을 실시하였다. Enterococcus 속에 속하는 105가지 균주 중 약 52%가 7가지 항생제 중 3개 이상의 항생제에 대해 내성을 보였고[20], Streptococcus 속에 속하는 178가지 균주 중 90% 이상이 7가지 항생제 중 최소 1가지에 대해 내성을 보였다[21]. 우유 내 존재하는 두 종의 병원성균 항생제 내성 문제는 유가공 식품의 안전을 위협할 수 있다. 또한, 항생물질의 내성은 2050년까지 1년에 백 만명의 죽음을 예상할 수 있는 매우 심각한 문제이다[22]. 따라서 여러 스트레스와 항생제 스트레스로부터 세포가 살아남는 기작을 명확히 이해하는 것이 필요하다. 이런 이유로 휴면기의 persister 세포와 세포의 빈 껍질(VBNC)을 구별하는 것은 연구의 정확성을 확보하기 위해 중요한 요인이 될 수 있다. VBNC는 감염을 회복시키고 원래의 상태로 돌아갈 수 있는 세포가 휴면 연속체의 일부가 아니며 동시에 오직 persister 세포만이 휴면기 상태이고 다시 생장할 수 있다[1]. 따라서 오랜 기간 동안 휴면 상태로 알려져 온 VBNC는 실제로 죽은 세포이며 VBNC는 persister 세포와 persister 세포가 아닌 세포의 죽음으로 인한 결과이다. 다양한 스트레스에 살아남을 수 있는 휴면기 세포 연구의 명확성을 위해서는 세포가 살아있는지 죽었는지를 결정하는 방법으로 DNA 염색같이 부정확하게 세포 껍질의 손상 여부로 판단하는 간접적인 방법을 활용하기보다는 TEM(Fig. 2)과 생균 계수법을 함께 활용해야 할 것이다.