동결건조한 Lactobacillus fermentum SK152 균주의 생존율에 미치는 동결보호제의 효과

Skim milk powder(BD, USA), glucose(Duksan, Korea), trehalose(대정화금, Korea), dextrin hydrate(대정화금, Korea) 등을 동결보호제 실험에 사용하였다. 유산균의 배양을 위해 Lactobacilli MRS broth(BD, USA)와 Bacto^TM Agar(BD, USA)를 사용하였다.

김치에서 분리한 Lactobacillus fermentum SK152(NCBI Accession No.: PRJNA318540)를 37°C에서 3회 계대배양한 후에 본 실험에 사용하였다. 이후 활성이 유지된 균주를 MRS 액체배지에 0.1%(v/v) 접종하고 24시간 동안 배양하였으며, 5,000 g, 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 0.85%(w/v) 생리식염수에 현탁하여 세척한 후에 실험에 사용하였다.

원심분리하여 회수한 SK152 균체를 skimmed milk powder, sucrose, trehalose, dextrin hydrate 10%(w/v) 용액에 각각 첨가하고 골고루 현탁하였다. —60°C에서 24시간 동안 동결한 후에 동결건조기(EYELA Co., Japan)를 사용하여 0.05 torr 조건에서 48시간 동안 건조하였다. 동결건조한 후에 시료를 골고루 분쇄하여 분말화하였으며, 저온(4°C) 및 상온(20°C)에 보관하면서 저장기간에 따른 생존률(%)을 측정하였다.

시료를 0.85%(w/v) 생리식염수에 현탁한 후에, 십진희석법을 사용하여 희석한 시료를 MRS 고체배지에 도말하였으며, 37°C에서 24–48시간 배양한 후에 형성된 colony 수를 측정하여 CFU(colony forming unit)로 표시하였다. 시료의 동결 전/후의 생존률은 다음과 같이 계산하였다[10].

L. fermentum SK152의 동결건조에 의한 생균수 감소에 동결보호제가 미치는 영향을 조사하기 위해 단당류(glucose), 이당류(trehalose), 다당류(dextrin hydrate) 및 skim milk powder 10% 용액과 SK152 균체를 각각 현탁한 후에 동결건조하였다. 동결건조한 후의 생존률을 비교한 결과, 각각 5.6%(dextrin), 2.2%(skim milk powder), 1.7%(glucose), 1.5%(trehalose) 로서, dextrin을 첨가한 경우의 생존률이 가장 높게 나타났다(Table 1, Fig. 1). Kang 등[10]에 의하면, L. fermentum MG901 균주를 동결건조할 경우의 생존률은 22%이었으며, skim milk powder 첨가에 의해 생존률 이 2배 이상 증가하였다. Lactobacillus salivarius W13의 경우, 동결보호제의 유무 및 종류에 따른 생존률이 0.01%에서 59.5%에 이르기까지 매우 큰 차이를 나타내었으며, skim milk powder와 sucrose 및 sodium glutamate의 조합이 가장 높은 생존률을 나타내었다[12]. Semyonov 등[13]은 Lactobacillus paracasei를 동결건조할 경우에 trehalose 농도와 maltodextrin 분자량이 생존률을 높히는데 중요하다고 보고하였다. 한편, Rathnayaka[14]는 Lactobacillus 속 유산균을 동결건조할 때 trehalose와 sucrose의 첨가가 효과적이었으나, 서로 간에 유의적인 차이가 없었다고 보고한 바 있다. 이 외에도, skim milk powder와 sucrose가 유산균의 세포막을 안정화시킴으로써 세포손상을 방지할 수 있다고 보고된 바 있으며[15], trehalose가 유산균의 동결건조에 효과적인 보호제로 보고된 바 있다[16,17]. 이상과 같이 기존의 연구사례에 비추어볼 때, 같은 Lactobacillus 속이나 종에 속하더라도 strain에 따라 저장안정성에 미치는 동결보호제의 효과가 서로 다를 수 있을 것으로 추정되었다.

Fig. 1. Cell viability of L. fermentum SK152 after freeze-drying. F/D, freeze-drying; CFU, colony-forming unit.

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동결건조한 L. fermentum SK152를 냉장(4°C) 및 상온(20°C)에 7–8주간 저장하면서 동결보호제의 종류에 따른 생존률을 조사하였다. 4°C 보관 시, 동결보호제의 종류에 상관없이 저장기간이 길어져도 생존률이 서서히 감소하는 경향을 나타내었다. 저장 8주 후의 생존률은 37%(dextrin)–90%(skim milk powder)에 이르렀으며, skim milk powder 첨가시에 가장 높은 생존률을 나타내었다(Table 2, Fig. 2). 한편, 20°C 보관 시에는 동결보호제의 종류에 상관없이 저장기간에 길어질수록 4°C에 비하여 생존률이 급격히 감소하는 경향을 나타내었다. 저장 7주 후의 생존률은 4%(dextrin)–12%(skim milk powder)에 이르렀으며, 이중 가장 높은 생존률을 나타낸 동결보호제는 skim milk powder이었다(Table 3, Fig. 2).

Fig. 2. Changes in the cell viability of freeze-dried L. fermentum SK152 during storage at 4°C (A) and 20°C (B), respectively.

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Kang 등[10]에 의하면, skim milk powder를 첨가하고 동결건조한 L. fermentum MG901을 40°C에서 4주간 보관하였을 경우의 생존률은 1.1%에 불과하였으나, 호박분말 첨가에 의해 5.1% 수준으로 증가하였다. 한편, L. acidophilus ATCC 4962를 동결건조하여 5°C 또는 28°C에 저장하였을 때에는 생균수 감소가 미미하였으나, 40°C에 저장하였을 경우에는 8주 후 생존률이 1% 이하까지 감소하였다[18]. Reddy 등[19]은 세 종류의 유산균을 동결건조한 후에 저장안정성을 비교하였는데, 균주에 따라 차이는 있었지만 maltodextrin이 생존률을 높이는데 가장 효과적이었다고 하였다. Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC 500의 경우, 동결건조하여 —85°C에서 49일간 보관했을 때의 생존률은 trehalose 34%, skim milk powder 22.4%, sucrose 13%로서, trehalose가 가장 우수하였다[20]. Lactobacillus rhamnosus 및 Lactobacillus casei 균주는 skim milk powder와 trehalose를 첨가하였을 때에 가장 우수한 안정성을 나타내었다[21]. 이외에, 상업적으로 널리 사용되는 Lactobacillus rhamnosus GG 균주의 경우에는 이당류 중에서 trehalose가 저장안정성 유지에 가장 우수한 결과를 나타내었다[22].

동결건조에 의한 생균수 감소는 동결과정에서의 ice crystal의 형성에 의해 세포막 및 세포벽, DNA가 손상될 뿐만 아니라, 세포막 지질성분의 산화, 고분자물질의 변성 등에 기인한 것이라고 알려지고 있으며[23,24], 동결건조에 대한 저항성과 저장기간 동안의 생존률은 세포막 지방산의 조성과 밀접한 관계가 있다고 하였다[25].

이상과 같이 이전의 연구사례에 비추어 볼 때, Latobacillus 속의 저장안정성에는 대체적으로 skim milk powder와 trehalose가 우수한 경향을 나타내었으며, 본 연구결과에서도 유사한 결과를 나타내었다. 그러나, 동결건조 후의 생존률은 균주 특이적인데다가 동결보호제의 종류에 따라 달라지기 때문에[11,18,26], 사용하는 균주에 따라 최적의 동결건조 조건 및 동결보호제를 선택하는 것이 바람직할 것으로 사료되었다.