프로바이오틱스를 첨가한 반려동물 사료 개발에 관한 연구 및 현황: 총설

프로바이오틱스는 인류 문명 초기부터 식품에 존재해 왔다. 음식 속 박테리아에 대한 우리의 지식은 빠르면 8,000–10,000년 전 부패와 중독 사례가 발생했을 때 시작된 것으로 추정된다[6]. 그러나 19세기 중반이 되어서야 루이 파스퇴르(Louis Pasteur)가 산(acid)을 형성하는 미생물과 우유 시큼함과 와인 발효에 미치는 미생물의 역할을 과학계에 알렸다[7]. 이 발견은 다른 미생물을 식별하고 식품 시스템에서 눈에 보이지 않지만 중요한 역할을 밝히는 것을 목표로 하는 일련의 실험을 촉발시켰다. 거의 반세기 후인 1907년에 노벨상을 받은 과학자 엘리 메치니코프(Elie Metchnikoff)는 발효유에 있는 젖산균이 특정 건강상의 이점, 특히 노화의 시작을 지연시키는 역할을 한다고 제안하였다[8]. 이는 응고된 우유(요구르트)를 정기적으로 섭취하는 불가리아의 100세 노인을 관찰한 데서 비롯되었다. 메치니코프는 자신의 저서 중 하나인 “생명의 연장”에서 락토바실러스가 질병과 노화 증상의 원인이 되는 부패성 신진 대사 폐기물에 대응하는 역할을 할 수 있다고 제안했으며, 따라서 건강 증진을 위해 특정 박테리아를 섭취한다는 개념이 태어났다. 이 흥미로운 이론은 향후 수십 년 동안 연구자들이 미생물 섭취 뒤에 숨은 건강 증진 메커니즘에 초점을 맞추도록 많은 영감을 주었다.

락토바실러스 외에도 포자형성균도 같은 시기에 발견되었다. 1876년에 Ferdinand Cohn은 박테리아를 Bacillus subtilis로 인식하고 명명했으며, Robert Koch가 Bacillus anthrax의 생활사를 기술한 직후였다[9]. Bacillus coagulans(원래 Lactobacillus sporogenes로 명명됨)는 나중에 아이오와 농업 실험소에서 응유에 들어 있는 것으로 기술되었으며, 이 유기체는 1932년에 성공적으로 분리되었다[10]. 바실러스(Bacillus) 미생물의 독특한 포자 형성 조건은 환경에서 생존할 수 있을 뿐만 아니라 연유의 진공 건조와 같은 특정 산업 공정을 견딜 수 있는 것으로 평가되었다. 이는 포자화된 박테리아가 산업적 식품 생산 과정에서 생존할 수 있는 잠재력을 가지고 있다는 초기 증거를 제공하였다.

21세기로 접어들면서 1994년 식이보충제 건강 및 교육법이 통과되면서 인간을 위한 프로바이오틱스로 판매되는 제품의 판매가 기하급수적으로 증가하였다[11]. 프로바이오틱스 강화 식품의 세계 시장은 2020년부터 2027년까지 연평균 7.9%의 성장률을 보이며 480억 달러에서 940억 달러로 성장할 것으로 예상된다[12]. 인간을 위한 기능성 식품에 대한 관심의 급증은 반려동물 식품 산업에서도 유사한 발전을 불러일으켰지만, 개를 위한 프로바이오틱스 사용에 대한 연구는 훨씬 적다. 예를 들어, PubMed 오픈 액세스 데이터베이스는 1990년부터 2021년 사이에 “인간” 및 “프로바이오틱스”에 대해 20,000개 이상의 출판물을 반환하는 반면, “개” 및 “프로바이오틱스”에 대해서는 대략 250개 정도의 출판물이 검색되었다. 인간에 비해 이용 가능한 연구의 규모가 작음에도 불구하고, 프로바이오틱스는 여전히 반려동물 보조제, 식품 및 간식으로 개를 위한 것으로 홍보되고 있으며 임상 실습에 사용하기 위해 수의사로부터 어느 정도의 정보를 수집하였다[13]. 빠르게 성장하는 이 시장에서는 새로운 프로바이오틱스 균주, 가공을 통한 생존 가능성, 인간에게서 관찰된 것과 유사한 건강상의 이점을 제공하는 능력에 대한 면밀한 평가가 필요하다.

프로바이오틱스(probiotic)라는 용어는 “앞”을 의미하는 라틴어 전치사 “pro”와 “생명”을 의미하는 그리스어 “biotikós”에서 유래되었다. 지난 수십 년 동안 프로바이오틱스의 정의는 프로바이오틱스의 의도된 용도와 이점의 다양한 측면을 통합하도록 개선되고 있다. “프로바이오틱스”라는 용어는 반려동물 사료를 언급할 때 종종 “직접 공급되는 미생물”과 같은 의미로 사용된다. 그러나 가장 최근의 정의와 이 장의 맥락으로 사용되는 정의는 “적절한 양을 투여했을 때 숙주에게 건강상의 이점을 제공하는 살아있는 미생물”이다[14].

동물 사료에 허용되는 프로바이오틱스 균주로 승인을 받기 위한 기준에는 성분의 구성 분석, 독성학적 잠재력, 잠재적 건강 부작용에 초점을 맞춘 동물 노출 평가를 검증하기 위한 프레임워크가 포함된다[15]. 미국 식품의약국(FDA) 수의학 센터는 미국사료관리관협회(AAFCO)와 함께 1989년 처음으로 동물 사료에 사용하기 위한 박테리아 및 효모 유기체 목록을 발행하였다. 이 목록은 수년에 걸쳐 개정되어 다음을 기반으로 한 새로운 유기체를 포함하였다. 주로 돼지와 가금류에 대한 연구가 가능하였다. 현재 반려동물에게 사용하기에 안전한 것으로 간주되는 비독성 세균 종이 41종에 달한다[16]. 이들 미생물은 세포벽의 구조, 산소 내성, 포자 형성 여부 등의 생리학적 특성에 따라 더 분류될 수 있다. 이러한 미생물이 공통적으로 공유하는 특성과 이를 독특하게 만드는 특성은 특정 식품 응용 분야에서의 잠재적인 용도를 평가하는 데 중요하다.

안전 및 규제 지침을 준수하는 것 외에도 일반적으로 프로바이오틱스 후보는 위장관에서 직면하게 되는 두 가지 주요 화학적 스트레스 요인인 산 및 담즙염에 대해 어느 정도 저항성을 가져야 한다[17]. 개의 소화 시스템은 병원성 미생물을 효과적으로 비활성화하고 다양한 종류의 섭취된 물질에서 영양분을 추출하는 메커니즘으로 진화하였다. 개의 위장관 생리학에 대한 종합적인 검토가 가능하며 잠재적인 프로바이오틱 미생물에 가장 큰 스트레스를 가할 수 있는 조건(예: 가장 낮은 위 pH, 가장 긴 위 및 상부 장 통과 시간)을 식별하는 데 유용한 참고 자료로 사용된다[18]. 예를 들어, 다른 관련 생화학적 성분(예: 소화 효소 및 담즙염)은 시험관 내 개 위장 모델 개발에 사용되었다[19]. 이러한 조건은 개의 식이에 사용하기 위한 미생물 스크리닝에도 적용될 수 있다.

또한 상업적으로 가공된 식품에 적용하려는 모든 균주는 열, 유통기한 연장, 식품 자체의 화학적 조성(예: 매트릭스 산도, 산소 존재, 수분활성도 또는 미생물 억제제의 존재와 같은 공정 관련 스트레스에 대해 높은 탄력성을 보여야 한다[20]. 반려동물 소유자에게 음식의 일부로 프로바이오틱스를 먹이는 것은 반려동물에게 매일 투여하는 편리함을 제공하는 동시에 기존 식품에 비해 제품의 인지된 가치를 높인다[21]. 그러나 이러한 특성을 고려하지 않고 프로바이오틱스를 선택하는 경우 상업용 식품 응용 분야에서 개별 균주의 탄력성은 여전히 의문의 여지가 있다. 시장에서 얻은 반려동물 사료의 프로바이오틱스 무결성을 조사한 연구에서 샘플링된 상업용 제품의 53%가 라벨의 균주 식별 및 집락 형성 단위 보증과 관련하여 심각하게 부적합한 것으로 나타났다[22]. 이는 동물이 섭취할 때 생존 가능성을 보장하기 위해 프로바이오틱스 균주의 검증이 필요함을 강조하는 것이다.

유기체가 장까지 안전하게 전달될 수 있는 경우 박테리아의 대사 활동은 계통에 따라 다르다. 모든 박테리아 종이나 특정 종의 계통이 동일한 대사 경로를 선호하는 것은 아니다[23]. Enterococcus, Lactobacillus 및 Bifidobacterium은 동물에게 가장 일반적으로 사용되는 프로바이오틱스로서 젖산을 1차 최종 산물로 생성한다. 전통적으로 젖산을 생성하는 박테리아 균주는 그람 양성 혐기성 또는 조건성 혐기성이며 포자를 형성하지 않는다[24]. 이들 균주는 또한 숙주 미생물군에 영향을 미칠 수 있는 과산화수소 및 박테리오신과 같은 다른 물질도 생산한다[25]. 개에게 부여되는 건강상의 이점은 최근 여러 리뷰에 요약되어 있으며, 대변의 질 개선과 겉보기 총 소화관 소화율, 미생물 발효 최종 산물 및 면역체계 반응에 대한 혼합 효과가 포함된다[26]. 그러나 식품 응용을 위한 영양 세포로서 요리 및 위장 통과와 관련된 스트레스로 인해 부상 및 사망에 더 취약하다. 이러한 미생물의 생존은 마이크로캡슐화와 같은 세포 보호 기술을 사용하여 향상될 수 있다[27]. 이는 비포자성 프로바이오틱스를 포함하는 기능성 식품의 미래를 위해 매우 중요한 연구 분야로 성장하고 있다.

많은 박테리아 종은 자신을 보호하기 위해 빠르게 변화하고 때로는 적대적인 조건에 대처할 수 있는 능력을 가지고 있다[28]. 가장 효과적인 적응 중 하나는 영양이 부족한 환경, 낮은 수분 활성도, 불리한 온도 또는 극한 pH에 반응하여 포자를 형성하는 것이다[29]. 포자화된 형태에서 미생물은 낮은 대사 및 호흡 활동을 특징으로 하는 휴면 상태로 퇴행한다[30]. Clostridia 및 Bacillus 종과 같은 그람 양성 박테리아는 박테리아 세포 내에 두꺼운 보호 장벽을 형성할 수 있다. 포자의 주요 층에는 코어, 펩티도글리칸이 풍부한 생식 세포벽 및 피질, 단백질성 코트 및 엑소스포륨이 포함된다. 환경 감지 메커니즘을 통해 포자 외부 막에 위치한 영양분 및 비영양소 수용체의 활성화와 같은 유리한 성장 조건이 감지되면 포자가 발아할 수 있다[31]. 대사적으로 휴면하는 미생물은 가공 조건에 대한 내성이 증가하고 저장 중 유통기한이 증가하기 때문에 조리 식품에서의 생존과 관련하여 유리할 수 있다[32]. 또한 포자는 영양 세포에 비해 더 높은 내열성을 나타내며 낮은 pH 조건과 외부 프로테아제 존재 하에서 지속된다. 박테리아가 적절한 환경에 도달하면 포자는 발아 과정을 시작하고 대사 활성 상태로 복원된다[33].

Bacillus spp.는 지난 10년 동안 송아지, 육계 및 새끼 돼지의 사료에서 평가된 포자 형성 속(genus)이다[34]. 이러한 연구의 주요 발견에는 반추 동물 소화관을 통한 포자 생존 검증, 성장 성능 개선 및 겉보기 전체 소화관 소화율 증가가 포함된다. 이 균주가 승인된 미생물 목록에 포함되어 있음에도 불구하고 반려동물의 식단에 B. coagulans에 대한 문서화된 보고는 단 하나뿐이다[33,35]. 그럼에도 불구하고 B. coagulans를 함유한 제품은 전국 매장에서 소비자가 구매할 수 있다. 예를 들어, B. coagulansGBI-30, 6086은 젖산을 생성하고 그람 양성이며 포자를 형성하는 막대 모양의 미호기성 박테리아이다. 이 균주는 미국 특허 번호 7,713,726에 따라 Ganeden Biotech(현재 위스콘신주 벨로이트 소재 Kerry의 자회사)의 연구자에 의해 개발되었다. 이는 2012년에 일반적으로 안전하다고 인정되는(GRAS) 지위를 부여받았으며 Food Chemical Codex(USP Monograph FCC 10)에 최초의 프로바이오틱 균주가 되었다. 분리체 이름 GBI-30, 6086은 ATTC(American Type Culture Collection) 지정 번호 PTA-6086을 사용하여 최적 성장 온도 30°C를 의미한다. 이 균주의 포자는 최대 90°C의 온도에 저항성이 있으며, 시험관 내 및 생체 내 평가에서 결정된 바와 같이 위산 및 담즙염에 의한 손상에 저항하면서 체내에서 발아할 수 있다[36]. 또한 독성 및 게놈 특성과 관련하여 이 균주의 안전성이 잘 확립되어 있다[37]. 따라서 이 균주와 이와 유사한 다른 균주를 반려동물 사료 제품에 통합할 수 있는 강력한 후보로 만들 수 있다.

적절한 프로바이오틱스 균주를 신중하게 선택하고 공정 조건을 통해 생존을 검증하더라도 제조업체는 제품 유효 기간이 끝날 때까지 생존 가능성을 보장하지 못할 수 있다. 유통 전반, 소매 상품화, 소비자 가정에서의 식품 취급 및 보관과 같은 통제되지 않은 상황은 시간이 지남에 따라 불리한 조건과 그에 따른 생존력 손실에 기여할 수 있다. 따라서 제품의 의도된 유효 기간 동안 직접 섭취한 미생물의 생존을 더욱 뒷받침하기 위해 추가 조치를 취할 수 있다. 마이크로캡슐화는 불리한 외부 조건에 대한 추가적인 장벽으로 프로바이오틱스 세포를 물리적으로 보호하는 기술이다. 분무 건조는 대규모 생산을 위한 캡슐화 방법 중 하나이다. 이 공정에는 액체 폴리머 용액에 세포를 분산시키고, 혼합물을 균질화하고, 용매(일반적으로 물)를 증발시켜 건조된 마이크로캡슐의 매트릭스를 형성하는 과정이 포함된다. 마이크로캡슐화는 또한 박테리아 배양 유제를 펙테이트, 카파-카라기난, 로커스트 빈 검, 젤란 검 또는 한천과 같은 외부 겔화제와 함께 공압출함으로써 달성될 수 있다[38]. 공압출된 재료는 탈수 및 냉각되면 캡슐을 형성하는 작은 물방울로 분해된다.

캡슐화 재료는 식품에 사용하도록 승인되어야 하고 미생물에 무독성이며 식품 매트릭스에 적합해야 한다. 예를 들어, 인산염, 아세트산염, 구연산염과 같은 단일 전하 이온이 존재하면 이온 경쟁을 통해 알긴산칼슘 캡슐이 조기 파괴될 수 있다. 더욱이 알지네이트는 일반적으로 낮은 pH 값과 열에 매우 민감하며 가교 구조를 잃어 이러한 조건에서 매우 쉽게 보호제로서의 기능을 손상시킬 수 있다[39]. 많은 반려동물 사료 매트릭스에는 무기 미네랄 염이 포함되어 있고 약산성인 경향이 있기 때문에 이는 특정 매트릭스에서 알지네이트 캡슐화의 성능이 저하될 수 있다. 다성분 마이크로캡슐을 생성하기 위해 알지네이트와 키토산 및 폴리-L-라이신을 결합하면 프로바이오틱스의 안정성을 향상시키는 동시에 캡슐 구조를 파괴하는 물질의 파괴적인 효과를 줄일 수 있다고 제안되었다[40]. 달걀 흰자, 레시틴, 유청 단백질 및 카르복시메틸 셀룰로오스도 식품 응용 분야에서 프로바이오틱스 캡슐화를 위한 알지네이트 뼈대를 강화할 수 있는 호환 가능한 물질로 제안되었다.

전분은 또한 성공적인 캡슐화 기질 역할을 하는 것으로 나타났다[41]. 전분을 캡슐화제로 고려할 때 전분 아밀로스:아밀로펙틴 비율이 효과에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 아밀로스 함량이 높은 옥수수 전분 과립은 천연 곡물 전분에 비해 열 및 소화 효소에 대한 저항성이 더 뛰어났다[42]. 캡슐화 기술의 혁신에는 프리바이오틱스, 프로바이오틱스 및 기타 생리활성 성분을 반려동물 사료 및 간식에 공동 캡슐화하는 것과 같은 다중 성분 기질이 포함된다. 캡슐화된 형태가 되면, 프로바이오틱스는 다음 섹션에서 논의되는 바와 같이 식품 생산 과정에 도입될 수 있다.

원하는 균주와 제제를 선택한 후, 프로바이오틱스가 동물에게 이점을 부여하기 전에 극복해야 할 몇 가지 장애물이 있다. 식품에 포함된 프로바이오틱스의 경우 가장 강렬한 스트레스 요인 중 하나는 열처리이다. 대부분의 반려동물 사료는 유통 기한을 연장하고 바로 먹을 수 있는 완제품에 병원성 미생물이나 독소가 남아 있을 위험을 줄이기 위해 어느 정도 조리되거나 상업적으로 멸균된다. 열처리의 기본 전제는 미생물 활동을 줄이거나 파괴하는 것인데, 이는 직접 공급되는 미생물을 포함시키는 데 역효과를 낼 수 있다. 미생물 박멸은 식품안전현대화법[43], 살모넬라로 오염된 반려동물 사료에 대한 FDA의 무관용 정책, 밀봉된 용기에 담겨 포장된 저산성 통조림 식품의 열처리에 대한 21 CFR Part 113과 같은 연방 규정에 의해 시행된다. 따라서, 표적 병원성 종이 효과적으로 비활성화되도록 식품 안전 계획 내에서 그에 따라 공정 제어가 개발된다.

외부 세포막과 펩티도글리칸 벽의 손상, 세포질 막 무결성의 손실, 세포 소기관, RNA, DNA 및 효소의 변성을 포함하여 영양 세포에 대한 열 작용에 대해 제안된 여러 메커니즘이 있다. 유기체와 열처리 강도에 따라 열의 작용으로 인해 이러한 현상이 하나 이상 발생할 수 있으며, 궁극적인 목표는 병원성 세포를 복구 불가능하게 손상시키는 것이다. 포자를 형성하는 미생물은 영양세포에 비해 더 큰 습열 저항성을 나타내는 것으로 보고되었다[44]. 포자의 내열성을 제어하는 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았다. 그러나 알려진 열 저항 요인에는 Ca²⁺와 같은 2가 양이온의 축적과 포자 코어의 탈수 상태가 포함된다. Dipicolinic acid(DPA)는 양이온을 킬레이트화하여 중요한 역할을 하며, 이는 코어 중심의 낮은 수분 환경과 높은 미네랄 밀도를 유지하는 데 도움이 된다[45]. 포자 형성 과정에서 DPA를 암호화하는 유전자를 보유한 미생물은 내열성이 증가하는 경향이 있다.